陈亮 《浙江大学》2002年博士论文
【摘要】： 茶组Sect．Thea(L．)Dyer属于山茶属Genus Camellia Linn．、山茶科Theaceae。除茶‘C．sinensis(L．)O．Kuntze’为广布种外，其它种几乎全产于中国南部与西南部，它是山茶属中最有价值的一个组，而茶又是茶组中最重要的一种。

作者对茶树基因组DNA提取方法、茶树(种内)资源遗传多样性、茶树资源的分子标记鉴别、茶组分子系统学和形态系统学等进行了较系统深入的研究，获得以下重要结果。 1、在前人研究基础上，建立了茶树基因组DNA的SDS-异丙醇提取法。该法提取缓冲液使细胞维持一定的渗透压，研磨时使细胞核基本保持完整；在细胞核被裂解之前去除细胞质中的茶多酚、大部分蛋白质和RNA；而后用SDS裂解细胞核，异丙醇或乙醇沉淀DNA，这样能经济、快速和有效地从富含茶多酚、茶多糖等次生物质的茶树新梢中提取基因组DNA。基因组DNA平均得率为527μg／g鲜重，经鉴定适合进行限制性酶切和RAPD扩增。基因组DNA质量以新梢最好，干梢次之；液氮(-196℃)冷冻保存好于-20℃保存。应用硅胶脱水干燥成功保存茶树新梢，对解决野外远距离采样具有实践意义。 2、从100个随机引物中筛选出20个用于对我国15份茶树(种内)资源遗传多样性的RAPD扩增，共得到1050个位点，平均52.5个／引物，70个／资源。在全部的137条谱带中，8条是共有的(占5.8％)，多态性程度达94.2％，资源间的遗传距离在0.16-0.62之间，平均为0.37，遗传多态性和遗传距离远比肯尼亚、韩国、日本等大，从DNA分子水平上更加证实了中国是茶树的原产地和起源中心。引物的多态性频度在0.07至0.93之间，总平均为0.47，属于比较高的多态性频度，其中引物S201多态性频度最小，平均为0.24；引物207最大，平均为0.83。类平均法聚类结果显示，可划分为3个类群，同时探讨了类群内和类群间的亲缘关系。 3、对原产于云南等地的24份茶树资源进行分子标记鉴别研究，表明RAPD标记在鉴别茶树资源方面非常有效。有3种独立的方法：1)特殊的标记；2)特异的谱带类型；3)不同引物提供谱带类型的组合，可用于茶树资源的分子标记鉴别。OPO-13等12个引物共存在15个和缺失3个特异标记，可以鉴别其中14份资源；引物OPO-13扩增的14种谱带类型可以鉴别10份资源；2-3个引物谱带类型的组合分别可以鉴别15、17和20份资源。利用最少数量引物获得最大鉴别能力，对 资源的分子鉴别尤为重要。OPO－13，OPG－12，OPO－18和 OPA－13等 4个引物带 型的组合可以鉴别所有24份资源，包括形态和生化成分上几乎没有差异的2株毗 邻大茶树。 4、从 Operon公司的 61个引物中，筛选出 15个用于 24种、变种茶组植物的 RAPD扩增，在所扩增得到的107条可重现谱带中（平均7＊条污物）有102条（平 均6．8条尺物）是多态的，多态性程度是95．3％。引物多态性频度在0刀个096之间， 总平均为0．30，其中OPO－19多态性频度最小，平均为0．16；OPG－15最大，平均 为0石0。利用ipD标记构建的分子系统树和SHMM主成分分析均可将茶组植物 分为“五室类群”和“三室类群”两大类。在UPGMA分子系统树上，两大类下 可分别再分3个和2个亚类群，这和茶组植物的细胞学、化学和数学分类法基本 一致。同时从遗传距离上探讨了一些种的亲缘关系和分子进化。 综上所述，RAPD标记不仅适合于茶树种内水平，也同样适合于组内种间水平， 为茶树及其近缘植物遗传多样性、亲缘关系和分类鉴别提供了新颖可靠的分子学 方法和证据。 5、通过对野生大茶树居群、其它茶树资源等的系统研究以及茶组分子系统学 分析，结合前人的茶组分类研究，把张宏达分类系统的42种4变种茶组植物进行 归并，对其形态学分类系统进行了修订。该系统以张氏系统“系”的划分为基础， 以子房室数、花柱分裂数和子房茸毛为主要依据，结合中轴大小、果皮厚度、花 冠大小、花尊茸毛及树型、枝叶等的形态特征，将它们归并为大厂茶Camellia tQCh。nge皿Is下．C．Zh。ig、大理茶 C toll删is（W W．S＊ith）MCIChi。f、厚轴茶 C c。icolumna Chang、秃房茶 C gythnogya Chang和茶 C s。enslA（L．）O．KntZe共 5种，在茶下分普洱茶C sin删is var。am。（Masters）im。a、白毛茶C sin。S0 var Pubilimba Chang 2变种。野生型茶树主要属于大厂茶、厚轴茶、大理茶、秃房 茶。栽培型茶树主要属于茶及普洱茶、白毛茶等变种。除茶为广布种外，其余4 种、2变种主要分布在我国云南、广西和贵州等地。茶组的系统演化途径可分成子 房多毛和无毛二条路线，由子房5室向3室，乔木向灌木，大花多瓣向小花少瓣 演化。